Thèse Année : 2023

Diffusion and propagation of lignocellulolytic enzymes in their polymeric substrate : The impact of polymer concentration and their activity

Diffusion et propagation des enzymes lignocellulolytiques dans leur substrat polymérique : impact de la concentration en polymère et de leur activité

Maike Petermann
  • Fonction : Auteur
  • PersonId : 1511160
  • IdRef : 229086829

Résumé

The valorisation of lignocellulosic plant biomass plays an important role in the transition towards a more sustainable economy. Due to the complexity of this material, its valorisation is challenging and needs a pre-treatment that is expensive. One way to reduce the costs of this step, is to use it in combination with a biological treatment. Here, specific enzymes are used in ‘soft’ conditions to hydrolyse the polysaccharides that constitute the biomass. This step is promising, but it lacks in efficiency. One approach for its optimisation is to better understand what happens during the enzymatic degradation of a polymer and then use this information to improve it. During the degradation, the enzyme is confronted with high concentrations of polymer and has to navigate a dense and complex environment to access its target sites. However, enzymes are poorly characterised at high substrate concentration and crucial questions need to be addressed. How does the presence of the polymer impact the mobility of the enzyme inside this structure? Does the activity of the enzyme impact its mobility? And is its activity in turn impacted by the high concentrations of polymer?These are the questions that guided this PhD project and were studied using an experimental approach that combines enzymology, physics and imaging. At first, we characterised our polymer, wheat arabinoxylan, using small-angle neutron scattering to determine its structure and network characteristics at different polymer concentrations. The latter is a key information for the diffusivity of the polymer solution and our later diffusion experiments. Then, we studied the enzymatic degradation of the polysaccharide by a xylanase at different substrate concentrations up to 50 g.L-1 using a colorimetric activity assay and size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering. While we did not see an effect of the polymer concentration on the initial reaction rate, we saw some indications that a higher polymer concentration led to the creation of smaller degradation products. Finally, we used fluorescence microscopy and imaging to study the diffusion of the active and inactive xylanase in the polymer solutions up to 90 g.L-1. We found that the diffusion of the enzyme did not follow the Stokes-Einstein relation but was governed by an effective viscosity, in-between the pure solvent and the polymer solution viscosity, and decreased with increasing polymer concentration. To address the link between the mobility and activity of the enzyme, we compared the diffusion of active and inactive xylanase. In the case of the active enzyme, the diffusion was accelerated, showing the link between enzymatic activity and mobility.All in all, these results increase our knowledge on enzymatic degradation of concentrated polymers. In addition, preliminary experiments pave the way for other physico-chemical techniques that can be used to further unravel the link between an enzyme’s activity and mobility.
La valorisation de la biomasse lignocellulosique fait partie des solutions envisageables pour la transition vers une économie durable. La complexité de cette biomasse nécessite un pré-traitement coûteux pour sa valorisation. Pour réduire les couts, il est possible de le combiner avec un traitement biologique. Pour cela, des enzymes spécifiques au substrat catalysent la déconstruction des polysaccharides de la biomasse sous conditions ‘douces’. Néanmoins, les pré-traitements biologiques sont peu efficaces. Pour les optimiser, il est important de comprendre ce qui se passe lors de la dégradation enzymatique d’un polymère et ensuite trouver des approches pour l’améliorer. Lors de la dégradation, l’enzyme est confrontée à une concentration élevée en polymère et doit se propager dans une structure dense et complexe. En général, les enzymes sont peu caractérisées à fortes concentrations en substrat, et plusieurs questions cruciales doivent être abordées. Comment est-ce que la présence du polymère impacte cette propagation ? Est-ce que l’activité de l’enzyme impacte sa mobilité ? Et cette activité, est-elle aussi impactée par la concentration élevée en polymère ? Ce sont les questions qui ont guidé ce projet de thèse, qui se fonde sur une approche expérimentale qui combine l’enzymologie, la physique et l’imagerie. Dans un premier temps, nous avons caractérisé le polymère, arabinoxylane extrait du blé, pour déterminer sa structure et les caractéristiques du réseau formé par ses chaînes à différentes concentrations en polymère. Ces caractéristiques sont des informations importantes pour les expériences de diffusion dans les solutions de polymère. Ensuite, nous avons étudié la dégradation enzymatique du polysaccharide à différentes concentrations par une xylanase, avec des mesures de vitesse de réaction et de la taille des produits. Nous n’avons pas constaté d’impact de la concentration en polymère sur la vitesse de réaction, mais nos résultats suggèrent qu’une forte concentration en polymère entraînerait des produits de réaction plus petits. Finalement, nous avons utilisé la microscopie à fluorescence pour étudier la diffusion de la xylanase active et inactive dans les solutions de polymère jusqu’à 90 g.L-1. Les résultats ont montré que la diffusion de l’enzyme ne suit pas la relation de Stokes-Einstein, mais qu’elle est déterminée par une viscosité effective, entre la viscosité du solvant et celle des solutions du polymère, et que la diffusion diminue avec la concentration en polymère. Pour étudier le lien entre l’activité et la mobilité de l’enzyme, nous avons comparé la diffusion de la xylanase active et inactive. Dans le cas de l’enzyme active, la diffusion était accélérée, ce qui montre un couplage entre l’activité et la mobilité de l’enzyme. Au total, ces résultats améliorent notre compréhension de la dégradation enzymatique des polymères concentrés. En complément, des expériences préliminaires ouvrent la voie à d’autres techniques physico-chimiques, qui peuvent être utilisées pour poursuivre l’étude du couplage entre l’activité et la mobilité d’une enzyme.
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Origine Version validée par le jury (STAR)

Dates et versions

tel-04960378 , version 1 (21-02-2025)

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  • HAL Id : tel-04960378 , version 1

Citer

Maike Petermann. Diffusion et propagation des enzymes lignocellulolytiques dans leur substrat polymérique : impact de la concentration en polymère et de leur activité. Microbiologie et Parasitologie. Institut National Polytechnique de Toulouse - INPT, 2023. Français. ⟨NNT : 2023INPT0061⟩. ⟨tel-04960378⟩
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